3. 组学数据工程基础
纵向EHR与组学联合分析的第一步，不是建模，而是把四类组学数据变成“可对齐、可比较、可追溯”的工程化资产。基因组、转录组、蛋白组、代谢组在物理测量层面差异极大：DNA测序读的是碱基序列，RNA测序读的是转录本片段，质谱读的是肽段和代谢物的质荷比与强度。但它们进入分析管线后，都必须回答同样三个问题：原始信号是什么格式、经过哪些预处理步骤、用什么指标判断这批数据能不能用。本节按“格式—预处理—质控”三条线，把四类组学数据的关键工程细节讲清楚。
一、四类组学数据的格式与信息层级
基因组与转录组共享测序技术底座，原始数据通常以FASTQ交付。FASTQ每条read包含四行：序列标识、碱基序列、可选描述、逐碱基质量值（Phred分数，Q = -10·log₁₀P，Q30表示错误率0.1%）。比对后得到SAM/BAM（二进制压缩版），记录read比对到参考基因组的染色体、位置、CIGAR字符串和比对质量。转录组在BAM之上再做转录本定量，常用Salmon、featureCounts或RSEM输出TPM、FPKM或count矩阵。变异检测则输出VCF，记录位点、REF/ALT、基因型GT、深度DP、基因型质量GQ等字段。
蛋白组与代谢组以质谱为核心。原始文件常见厂商格式（.raw、.wiff、.d），经转换后进入开放格式mzML/mzXML，其中按scan保存保留时间、质荷比m/z和强度。蛋白组鉴定结果常用mzIdentML或pepXML，定量结果整理为蛋白/肽段×样本的强度矩阵；代谢组则输出代谢物特征表（feature table），包含m/z、保留时间RT、强度及注释信息。四类数据最终都要落到“特征×样本”的矩阵，并附带样本元数据，才能与EHR时间轴对齐。
二、预处理流程的关键差异
四类数据的预处理并非同一套模板。基因组预处理的核心是“比对—去重—重校准—变异检测”。以全基因组重测序为例，典型命令链是：fastp做接头去除和低质量碱基修剪，BWA-MEM将read比对到GRCh38，samtools排序后用Picard MarkDuplicates标记PCR重复，再用GATK BaseRecalibrator做碱基质量重校准，最后HaplotypeCaller输出VCF。这里有一个容易忽略的工程细节：参考基因组版本必须与EHR中已有的变异注释、转录本坐标保持一致，否则后续与临床表型关联时会出现坐标错位。
转录组预处理多了“剪接感知比对”和“定量归一化”两步。STAR或HISAT2能处理跨外显子的read，featureCounts按基因模型计数后，必须做文库大小和基因长度归一化。TPM与FPKM的区别在于TPM先归一化基因长度再归一化文库，使各样本TPM总和一致，更适合跨样本比较。若样本来自不同批次，还需用ComBat或limma removeBatchEffect做批次校正，但校正前应先用PCA确认批次效应是否真实存在。
蛋白组预处理的起点是质谱峰检测与对齐。DIA数据常用Spectronaut或DIA-NN，DDA数据常用MaxQuant或MSFragger。搜库时需设定固定修饰（如半胱氨酸碘乙酰胺化）和可变修饰（如甲硫氨酸氧化），并用靶标-诱饵策略控制FDR在1%以内。定量矩阵中缺失值不能简单填0，因为“未检出”与“真实为零”含义不同，常用KNN或MinDet填补，但缺失率超过30%的蛋白建议直接剔除。
代谢组预处理的难点在峰对齐和注释。XCMS或MZmine完成峰检测、保留时间对齐和去噪后，用内标（如氘代苯丙氨酸）做强度归一化，再经log转换和PQN（概率商归一化）消除样本间总体浓度差异。注释环节依赖HMDB、METLIN等数据库，一级质谱匹配精度通常要求m/z偏差小于5 ppm，二级谱图匹配则用MS/MS相似度打分。
三、质量控制指标与判断依据
质控不是“跑完流程看一眼”，而是要在每个阶段设置可量化的放行标准。下表给出一组教学示例阈值，实际项目应根据测序深度、质谱平台和样本类型调整。
| 组学类型 | 关键质控指标 | 示例放行阈值 | 异常时的常见处理 |
|---|---|---|---|
| 基因组 | Q30比例、比对率、平均深度、Ti/Tv | Q30>85%，比对率>95%，深度≥30×，Ti/Tv≈2.0 | 低质量样本重测；深度不足区域补测 |
| 转录组 | rRNA比例、比对率、基因检出数、PCA离群 | rRNA<10%，比对率>80%，检出基因>12000 | rRNA偏高时优化去rRNA步骤；离群样本核查RNA完整性 |
| 蛋白组 | 肽段数、蛋白数、缺失率、QC样本CV | 肽段>8000，缺失率<30%，CV<20% | 缺失率过高时检查上样量与色谱稳定性 |
| 代谢组 | QC样本RSD、峰数、内标响应 | RSD<30%，峰数稳定，内标CV<15% | RSD超标时重新校准质谱或剔除该批次 |
四、从组学矩阵到联合分析的就绪状态
当四类组学数据都完成预处理和质控后，工程上应形成一份“分析就绪”的数据包：每个组学一张特征×样本矩阵，行名是特征标识（基因Ensembl ID、蛋白UniProt ID、代谢物HMDB ID），列名是样本ID；另有一张样本元数据表，包含样本ID、患者ID、采样时间点、组学类型、批次、质控是否通过。矩阵中的缺失值、归一化方法和版本号都要记录在数据字典中。只有做到这一步，纵向EHR中的多次随访记录才能与组学特征按患者和时间点正确连接，后续的差异分析、多组学整合和纵向轨迹建模才有可靠的数据基础。