3. 实验设计中的随机化与区组化

你在 RNA-seq 项目中遇到过这种痛苦吗？数据跑完，主成分分析一出来，第一主成分不是处理 vs 对照，而是“第一批送样的样本” vs “第二批送样的样本”。如果碰上了，八成是实验设计时就埋下了批次效应的种子。

我个人的经验是：后期用 ComBat、limma removeBatchEffect 这些统计方法去校正，虽然能修，但总归是“亡羊补牢”。更聪明的做法，是在你开始提 RNA 之前，就用实验设计把批次效应摁死在摇篮里。今天我就跟你聊聊两个最核心的手段——随机化与区组化。

随机化：让批次效应“平均化”

随机化的思路其实很简单：把样本完全随机地分配到不同批次、不同凝胶泳道、不同测序 lane 中。这样一来，任何潜在的批次效应会均匀分布在所有比较组中，不会系统性地偏向某一边。

我见过最典型的错误做法是什么？把第一批收集的全部病例样本一起提 RNA、一起建库；第二批才收集的对照样本，再一起提、一起建库 —— 这时候，批次效应和生物学差异完全混杂，神仙都分不开。你看到的结果，到底是处理导致的差异，还是两批测序试剂盒效价不同导致的差异？说不清楚。

所以，我建议从一开始就做好随机分组的计划。比如你手上有 24 个样本，12 个处理组、12 个对照组，分 2 批上机。那每批里应该各有 6 个处理、6 个对照。

# 一个最简单的随机分配示例（R 语言）
set.seed(2025)  # 固定随机种子，可复现
sample_all <- 1:24
group <- rep(c("Trt", "Ctrl"), each = 12)
batch  <- rep(NA, 24)

# 随机将样本分配到批次
batch[sample(1:24, 12)] <- "Batch1"
batch[is.na(batch)]     <- "Batch2"

# 看看每组在每个批次中的数量
table(group, batch)

输出类似这样，每批次两组各 6 个，完美平衡：

          batch
group      Batch1 Batch2
  Trt      6      6
  Ctrl     6      6

区组化：把已知混杂因素“关进笼子里”

随机化很好，但它不能保证每个批次里关键变量的分布完全均衡 —— 尤其当样本量比较小时，随机分配也可能失衡。这时候就需要区组设计上场了。

区组设计的核心是：把一些已知的、可能影响结果但又无法直接控制的变量（比如性别、年龄、收集日期、人种等）作为“区组因素”，然后保证在每个批次内，这些因素的分布与总体一致。说白了，就是“分层后再随机”。

我曾经在一个小鼠 RNA-seq 项目中遇到过这种情况：我们要比较 A 品系和 B 品系各 8 只，但样本收集需要 3 天。如果不管，可能第一天全是 A 品系、第二天全是 B 品系，那品系差异和日间差异就混在一起了。我当时的做法是：把每天作为区组，每天内随机安排 2-3 只 A、2-3 只 B，保证每天两个品系各一半左右。这样即使不同天的建库质量有波动，也不会影响品系比较的公正性。

实践上，你可以先绘制一份样本注释表，然后手动或借助工具检查每个批次内各因素的频次：

如果发现某个批次里性别比例严重偏离（比如 Batch1 只有男性），那就需要调整。当然，你也可以用 R 的 blockrand 包来自动生成区组随机计划。

一张图看懂随机化 + 区组化

为了更直观，我画了下面这个流程图。它展示了样本如何经过“随机化”与“区组化”双重筛选，最终分配到两个批次中：