3. 长读长WGS数据质控与预处理

长读长全基因组测序（WGS）下机后的第一道工程关口，不是比对，也不是变异检测，而是把原始数据整理成“可信、干净、可追溯”的输入。长读长平台（PacBio HiFi、ONT）与短读长在数据形态上有本质差异：读长可达 10–20 kb，单条读段内部质量波动明显，且常伴随接头、嵌合、孔道异常等平台特有噪声。若跳过质控直接进入组装或比对，错误会以“低质量碱基被当作真实变异”“接头序列被误认为结构变异断点”等形式放大到下游。

原始数据格式：从下机文件到可分析读段

长读长 WGS 的原始数据通常以 FASTQ 或 BAM 形式交付。FASTQ 每条记录四行：@read_id、碱基序列、+、逐碱基质量值（Phred 分数，Q 值）。Q 值定义为 Q = -10·log10(P_error)，Q10 表示 10% 错误率，Q20 为 1%，Q30 为 0.1%。PacBio HiFi 读段通常已做过环形一致性校正，整体 Q 值较高（常见 Q20–Q30 区间）；ONT 原始读段（simplex）平均 Q 值偏低，需依赖后续校正或高质量模式（如 duplex、Q20+ 试剂）提升。

BAM 格式则把序列、质量值、比对坐标、标签（如 MM/ML 甲基化标签、qs 等）打包在一起，适合已比对或需保留元信息的数据。工程上建议：原始 FASTQ 保留一份只读副本，所有过滤操作输出新文件，不覆盖原始数据，确保可回溯。

质量评估指标：看什么、怎么判断

长读长质控不能只看单一 Q 值。常用指标包括：读长分布（N50、最长读长、读长直方图）、质量值分布（平均 Q、Q 值随读长位置变化）、GC 含量分布、接头含量、重复序列比例、以及污染物种比例。工具层面，NanoPlot、LongQC、NanoStat、seqkit stats 可快速给出统计摘要；FastQC 对长读长支持有限，仅作参考。

判断标准应结合项目目标：若目标是 de novo 组装，N50 与最长读长权重更高；若目标是 SV 检测，则需关注读长是否足以跨越重复区域，以及质量值是否在断点附近可靠。示例性阈值（非实测结论）：ONT simplex 数据平均 Q ≥ 10、N50 ≥ 10 kb 可进入初步组装；HiFi 数据平均 Q ≥ 20、N50 ≥ 15 kb 通常满足高置信变异检测需求。

接头去除与低质量过滤

接头去除是长读长预处理的核心步骤之一。PacBio 数据常用 lima 识别并去除 SMRTbell 接头；ONT 数据可用 Porechop、NanoFilt 或 Chopper 处理测序接头与嵌合读段。实际操作中，先运行接头检测工具生成报告，确认接头类型与比例，再执行去除，避免“一刀切”误删真实序列。

低质量过滤通常按长度与平均质量双阈值执行。例如使用 NanoFilt -q 10 -l 1000 保留平均 Q ≥ 10 且长度 ≥ 1000 bp 的读段；Chopper -q 10 -l 1000 可流式处理并保留质量分布信息。过滤后应重新统计读长与质量分布，确认 N50 未因过滤而严重下降。若过滤后读长骤降，说明阈值过严或原始数据质量本身偏低，需回看建库与测序环节。

# 示例：ONT 数据接头去除与质量过滤
porechop -i raw.fastq -o trimmed.fastq --threads 8
nanoFilt -q 10 -l 1000 --headcrop 50 --tailcrop 50 trimmed.fastq > clean.fastq
seqkit stats clean.fastq

污染检测：别让外源序列混入

污染检测常被忽视，但在长读长 WGS 中尤为关键。常见污染来源包括：样本间交叉污染、试剂或环境微生物、载体序列、以及人源背景（当研究非人样本时）。检测方法可分两步：先用 Kraken2 或 Centrifuge 对读段做物种分类，统计非目标物种比例；再用 FastQ Screen 或 BLAST 对疑似污染读段做确认。若非目标物种占比超过预设阈值（如 5%），应标记样本并回溯实验记录。

质控与预处理流程总览

下图把本节涉及的核心对象、处理顺序与判断关系集中呈现：从原始 FASTQ/BAM 出发，经过质量评估、接头去除、低质量过滤、污染检测，最终输出可用于比对或组装的 clean reads，并保留每一步的统计报告。

整个流程的关键在于“先评估、再处理、后验证”。接头去除与低质量过滤会改变读长与质量分布，因此每一步之后都应重新统计；污染检测则决定样本是否值得继续分析。只有把原始数据整理成可解释、可复现的 clean reads，后续的比对、组装与变异检测才有可靠基础。