📚 课程目录第3章长读长数据预处理与质控工程

3. 长读长数据预处理与质控工程

长读长测序的预处理与质控，与短读长有本质区别。短读长数据通常以 FASTQ 为起点，质控围绕碱基质量、GC 分布和接头污染展开；而长读长平台（如 PacBio HiFi、ONT）在产出 FASTQ 之前，还经历了一个从原始电信号或光信号到碱基序列的转换过程。这个转换过程直接决定了后续串联重复与复杂变异分析的可用性。因此，本节把预处理与质控视为一条“信号—序列—过滤—评估—保留”的工程链路，而不是简单的软件调用。

从原始信号到碱基识别：理解 basecalling 的工程含义

以 ONT 为例，测序仪输出的是 FAST5/POD5 格式的原始电流信号。basecalling 模型（如 Guppy、Dorado）将电流信号解码为碱基序列，同时给出每个碱基的质量值。PacBio 则通过 SMRT Cell 采集荧光脉冲，经初级分析生成 HiFi 读长。对重复区域分析而言，basecalling 的关键参数是模型选择与是否启用甲基化调用。例如，Dorado 的 sup 模型精度高但速度慢，fast 模型适合快速筛查；若后续需要分析重复区域的甲基化状态，应在 basecalling 阶段就启用甲基化标记，否则无法回溯。

# 示例：使用 Dorado 进行 basecalling（参数为教学示例）
dorado basecaller sup pod5_dir/ \
  --emit-moves \
  --reference ref.fa \
  > calls.bam

# 将 BAM 转换为 FASTQ
samtools fastq -T MM,ML calls.bam > reads.fastq

这里 --emit-moves 保留碱基与信号的对应关系，对后续信号级重复分析有价值；--reference 用于比对辅助的碱基识别，可提升重复区识别准确度。需要强调的是，basecalling 不是“一次性黑箱”，模型版本、是否启用 moves、是否保留甲基化信息，都会影响下游重复区域的可分析性。

接头去除与低质量过滤：保留重复区的关键取舍

长读长文库常带有测序接头和条形码。接头残留会干扰比对和组装，尤其在串联重复区域，接头序列可能被错误地当作重复单元的一部分。常用工具包括 Porechop、Porechop_ABI、NanoFilt 等。接头去除后，应进行低质量过滤。但这里有一个重要原则：面向重复区域保留的质控，不能简单套用短读长的严格质量阈值。重复区域本身往往测序质量偏低，过度过滤会把真正携带重复扩增或收缩的读长一并丢弃。

建议采用“分层过滤”策略：先按长度和平均质量做粗过滤，再对包含重复特征的读长单独放宽阈值。例如，NanoFilt 可设置 --min-length 1000 --min-quality 7 作为基础过滤；对于已知重复区域附近的读长，可保留质量低至 5 的读长，并在后续分析中通过比对和一致性校正来弥补。过滤后应记录保留率，若保留率低于 70%，需要检查是否阈值过严或文库质量存在问题。

读长与质量分布评估：看什么、怎么判断

质控评估常用 NanoStat、NanoPlot、LongQC 等工具。对重复区域分析而言，重点观察四类指标：读长 N50、读长分布尾部、平均碱基质量和质量沿读长的分布。N50 反映长读长的整体能力，但重复区域更依赖“最长的那部分读长”是否能跨越整个重复区。因此，应关注读长分布中大于 10 kb 或 20 kb 的比例，而不是只看均值。

质量分布方面，短读长通常关注 Q30 比例；长读长则应关注 Q10、Q15 等较低质量区间的比例，以及质量是否在读长末端明显下降。若质量沿读长呈“前高后低”，说明末端信号衰减，重复区域若位于读长末端，其可靠性会显著降低。此时可考虑在比对时对末端进行软剪切，或使用一致性校正工具（如 Racon、Medaka）提升重复区精度。

污染检测：不可忽略的“隐性重复”来源

污染检测在重复区域分析中尤为关键。细菌、真菌或宿主 DNA 污染可能携带与目标重复序列相似的片段，造成假阳性扩增或错误组装。常用方法包括 Kraken2 分类、Centrifuge 比对，以及基于 rRNA 比例的快速筛查。若样本中 rRNA 残留超过 10%，通常提示文库富集不充分，需要重新处理。对于重复区域，还应特别关注污染序列是否含有与目标重复单元同源的片段——这类污染无法通过常规分类完全排除，需要结合比对位置和重复单元一致性进行人工核查。

面向重复区域保留的质控指标设计

常规质控指标（如 Q30、N50）不足以判断数据是否适合重复区域分析。建议补充以下指标：重复区覆盖读长数（有多少条读长覆盖目标重复区域）、跨越重复区完整读长比例（读长是否完整跨越整个重复区，而非仅部分重叠）、重复区平均质量（在放宽阈值后，重复区碱基的平均质量是否仍可接受）。这些指标应在过滤前后分别计算，以评估过滤策略对重复区域的保留效果。

实操建议：在质控报告中增加一个“重复区域保留率”字段，定义为过滤后仍覆盖目标重复区的读长数除以过滤前覆盖该区域的读长数。若该值低于 0.6，说明当前过滤策略对重复区域过于激进，应调整长度或质量阈值，或对重复区读长单独处理。

一个可复用的质控检查清单

检查项	推荐阈值/观察点	异常处理
basecalling 模型	sup 模型；重复区分析启用 moves	切换模型重新识别
接头残留	< 1% 读长含接头	重新运行 Porechop
过滤后保留率	≥ 70%	放宽质量阈值
读长 > 10 kb 比例	≥ 20%（重复区分析）	检查文库或富集方案
重复区覆盖读长数	≥ 30×	补充测序或调整过滤
污染比例	rRNA < 10%，宿主 < 5%	重新建库或去污染

预处理与质控不是“跑完工具就结束”，而是一个需要根据下游重复区域分析目标反复调整的工程环节。核心原则是：在去除接头、低质量和污染的同时，尽可能保留跨越重复区域的完整读长。只有把质控指标与重复区域保留率绑定，才能为后续的串联重复分型、复杂变异检测提供可靠的数据基础。