4. 初级分离与浓缩
发酵液或细胞破碎液经过离心、过滤去除菌体和大颗粒杂质后，得到的粗酶液体积大、酶浓度低，且仍含有大量杂蛋白、核酸、多糖和小分子代谢物。初级分离与浓缩阶段的任务，是在尽量保持酶活性的前提下，把目标酶从大量杂质中初步“提”出来，并把体积缩小到后续层析可接受的范围。本节围绕沉淀法、超滤浓缩与透析、萃取法三条技术路线展开，并以硫酸铵分级沉淀纯化蛋白酶为案例，说明参数如何确定、操作如何控制、结果如何判断。
一、沉淀法：降低溶解度，让目标酶选择性析出
蛋白质在水溶液中的溶解度由表面亲水基团与水化层、电荷排斥共同维持。沉淀法的共同思路是破坏这种稳定状态，使溶解度下降而析出。三种常用方式的作用机制不同，操作要点也不同。
盐析通过加入高浓度中性盐（硫酸铵最常用）争夺水分子，破坏蛋白质水化层，同时中和表面电荷。硫酸铵溶解度大、对酶变性作用小、价格低，是工业上最常用的盐析剂。盐析的特点是“分段沉淀”：不同蛋白质在同一盐浓度下的溶解度不同，因此可用不同饱和度把杂蛋白与目标酶分开。硫酸铵饱和度通常用25℃下的饱和浓度（约4.1 mol/L，即761 g/L）为基准换算，加入量需按溶液现有体积和温度查表或计算，不能简单按质量分数估算。
有机溶剂沉淀利用乙醇、丙酮等降低水的介电常数，增强蛋白质分子间静电引力而聚集。其沉淀能力强、分辨率较高，但有机溶剂易使酶失活，因此必须在低温（0～4℃）下缓慢加入，并控制最终浓度。乙醇沉淀常用于血浆蛋白和部分工业酶，操作时需边搅拌边滴加，避免局部浓度过高。
等电点沉淀利用蛋白质在等电点时净电荷为零、分子间排斥最弱、溶解度最低的特性。对已知等电点的酶，可把pH调至pI附近使其析出。该方法试剂消耗少，但分辨率有限，常与盐析或有机溶剂沉淀联合使用。
二、超滤浓缩与透析：按分子量“筛”出水和盐
超滤以压力为驱动力，让水和小于截留分子量的溶质透过膜，而目标酶被截留，从而实现浓缩和除小分子杂质。选择膜包时，截留分子量一般取目标酶分子量的1/3～1/5，既保证截留率，又兼顾通量。例如目标蛋白酶约30 kDa，可选10 kDa或5 kDa膜。操作中需控制跨膜压差和错流流速，压差过大会造成浓差极化和膜污染，通量迅速衰减。
透析则依靠浓度梯度，把小分子盐或缓冲液成分通过透析袋换出。它不浓缩体积，主要用于换缓冲液、去除硫酸铵。工业上常用切向流超滤系统同时完成浓缩与透析（透滤）：先浓缩到较小体积，再加入不含盐的缓冲液继续超滤，把残留硫酸铵稀释带出。判断终点可看电导率下降到目标缓冲液水平，或按透滤体积达到浓缩体积的5～10倍估算。
三、萃取法：双水相与反胶束
双水相萃取利用两种亲水性聚合物（如PEG与葡聚糖）或聚合物与盐（如PEG与磷酸盐）在水中形成两相，目标酶按表面性质分配于一相，从而实现与杂蛋白、核酸的分离。它处理量大、条件温和、易于连续化，适合直接从含菌体的粗液中提取胞内酶。关键参数是PEG分子量与浓度、盐种类与浓度、pH和相比，需通过小试测定分配系数和回收率。
反胶束萃取是在有机相中借助表面活性剂形成纳米级“水池”，亲水性的酶被包裹其中，而疏水性杂质留在有机相。通过调节pH、离子强度和表面活性剂浓度，可让酶在前萃、反萃两步中选择性转移，实现浓缩与纯化。该方法对有机溶剂耐受性好的酶更有优势，工业化案例相对少于双水相。
四、案例：硫酸铵分级沉淀纯化蛋白酶
假设某发酵液经离心除菌后得到粗酶液5 L，蛋白酶比活约12 U/mg，总蛋白约40 g。小试时按10%梯度从20%到70%饱和度分别沉淀，测定各段沉淀复溶后的酶活与蛋白量，发现目标酶主要落在30%～60%区间，而大量杂蛋白在0～30%段析出。据此确定工业操作方案：
- 粗酶液降温至4℃，用稀酸或缓冲液把pH调至酶稳定且远离其等电点的值（示例取pH 7.0），记录初始体积。
- 按0～30%饱和度计算所需固体硫酸铵质量，边搅拌边缓慢加入，溶解后继续搅拌30 min，4℃静置1 h，离心弃沉淀。
- 取上清，按30%→60%饱和度补加硫酸铵，同样缓慢加入、搅拌、静置，离心收集沉淀。
- 沉淀用少量pH 7.0缓冲液复溶，得到体积约300 mL的浓缩液，再经10 kDa超滤膜透滤去除残留硫酸铵，直至电导率接近缓冲液本底。
结果判断不能只看“有没有沉淀”，而要看三个指标：比活是否上升、目标酶回收率是否可接受、杂蛋白去除是否明显。示例中若复溶液总蛋白降至6 g、酶活回收约70%，则比活由12 U/mg升至约56 U/mg，纯化倍数约4.7倍，说明分段有效；若回收率低于50%，应检查加盐速度、静置时间和离心温度，或回到小试缩窄分段区间。需要强调，上述数值为教学示例，实际工艺必须通过小试和放大验证确定。
三条路线并非互斥：沉淀法适合大体积粗液的初步浓缩与分级，超滤透析负责脱盐和进一步浓缩，双水相萃取则可在含菌体或高杂质体系中直接捕获目标酶。实际工艺常按“沉淀→超滤透滤→层析”组合，把每一步的体积、比活和回收率记录清楚，才能判断整个初级分离段是否达到为后续精制减负的目的。