1. 工业发酵菌种保藏与复苏操作

保藏对象与操作链

本案例处理一株工业发酵生产菌（示例设定为枯草芽孢杆菌工程菌 BS-01，用于产中性蛋白酶）。保藏采用20% 甘油管 −80 ℃ 冻存方式，复苏采用温水快融 → 平板划线 → 液体活化的两级活化路径。核心控制点有三个：甘油终浓度、冻存前菌体处于对数中后期、复苏时避免反复冻融。

甘油管制备的关键参数与操作

甘油母液先配成 40%（v/v）并 121 ℃、15 min 湿热灭菌，冷却后与等体积菌液混合，得到终浓度 20%。菌液浓度控制在 OD₆₀₀ 0.6–0.8，此时菌体处于对数中后期，存活率与复苏一致性最好。混合后冰上静置 10 min 使甘油渗透平衡，再分装 1.0 mL/管。

降温环节使用程序降温盒（异丙醇填充）置于 −80 ℃ 冰箱，实现约 −1 ℃/min 的降温速率；若无程序降温盒，可先将冻存管置于 −20 ℃ 1 h 再转入 −80 ℃，但存活率会略低。冻存管标注菌株编号、日期、代次与操作人。

复苏活化操作与记录

1. 从 −80 ℃ 取出目标冻存管，立即置于 37 ℃ 水浴，轻摇至仅剩少量冰晶（约 1–2 min），不得长时间浸泡。
2. 用 75% 乙醇擦拭管壁后开盖，取 100 μL 菌液涂布或划线于 LB 琼脂平板，37 ℃ 培养。
3. 记录可见菌落出现时间与菌落形态（形状、边缘、表面、颜色、直径），与保藏前同一菌株的记录逐项比对。
4. 挑取单菌落接种 5 mL LB 液体，37 ℃、200 r/min 培养，记录 OD₆₀₀ 达到 0.6 所需时间。

保藏效果判定标准