3. 样品采集与制备实战

大肠菌群检测结果的可靠性，首先取决于样品是否具有代表性，其次取决于样品从采集到接种之间是否保持了原始微生物状态。本节围绕固体、半固体、液体三类食品基质，讲清楚采样方案如何设计、均质与稀释如何操作、增菌液如何制备，以及哪些关键控制点必须记录。

一、采样方案的基本逻辑

大肠菌群是反映食品加工卫生状况的指示菌，采样方案必须与检验目的匹配。若用于判定批次是否合格，应按分层随机抽样，从同一批次的多个最小销售包装中抽取；若用于排查生产环节污染，则应按工序取样，覆盖原料、半成品、关键接触面和成品。无论哪种目的，采样量都应满足“检验用量 + 复检留样”的要求，一般每个样品不少于 200 g 或 200 mL，并单独留取一份同批样品冷藏备查。

采样工具必须无菌。固体样品用无菌勺、无菌镊子或无菌取样器；液体样品用无菌移液管或无菌采样瓶；包装表面样品用无菌棉拭子配合模板。采样后应尽快送检，常温样品在 2 h 内送达，需冷藏的样品在 0～4 ℃ 条件下不超过 4 h。采样单上至少记录样品名称、批号、采样地点、采样时间、采样人、样品状态和保存条件。

二、三类基质的采样与制备差异

固体食品（如肉制品、糕点、坚果）采样时应注意部位代表性。以整块熟肉为例，先用无菌刀去除表层，再取内部约 25 g 放入无菌均质袋。制备时按 1:10 比例加入无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液，即 25 g 样品加 225 mL 稀释液，用拍击式均质器拍击 1～2 min，形成 10⁻¹ 匀液。颗粒较硬的样品可适当延长拍击时间，但不宜超过 3 min，以免产热影响菌体活性。

半固体食品（如果酱、乳酪、凝胶类甜品）黏度大、不易混匀，采样后应先在水浴中适当回温，但温度不超过 40 ℃。称取 25 g 加入含玻璃珠的无菌锥形瓶，加 225 mL 稀释液后剧烈振荡 2～3 min，或使用均质器低速处理 30～60 s。若样品含防腐剂或酸度较高，应在稀释液中加入中和剂，并在记录中注明。

液体食品（如饮料、乳品、酱油）采样前应充分摇匀，取样量按检验项目确定。制备 10⁻¹ 匀液时，吸取 25 mL 样品加入 225 mL 稀释液，充分混匀。含气饮料需先缓慢排气，避免取样时产生大量泡沫导致体积不准。乳品等高蛋白液体在稀释后可能出现絮状物，属正常现象，不影响后续接种。

三、梯度稀释与增菌液制备

10⁻¹ 匀液制备完成后，需在 15 min 内完成接种，避免菌体因稀释液渗透压或温度变化而受损。梯度稀释采用“每管 9 mL 稀释液 + 1 mL 上一级匀液”的方式，依次制备 10⁻²、10⁻³ 等稀释度。每次吸取前必须换用新的无菌吸头，并在稀释液中反复吹吸 5～8 次混匀。稀释过程应在无菌超净台内完成，管口靠近酒精灯火焰。

增菌液以月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤为例。按产品说明称取干粉，加热溶解后分装至含倒置小导管的试管，每管约 10 mL，121 ℃ 高压灭菌 15 min。灭菌后小导管内不得有气泡，若有气泡需重新排气或更换试管。接种时每个稀释度接种 3 管，每管 1 mL，接种后轻轻摇匀，置于 36 ℃±1 ℃ 培养 24～48 h。若样品预计污染较重，可增加 10⁻⁴、10⁻⁵ 稀释度，以保证阳性管落在可计数范围内。

四、关键控制点与记录

整个流程中，以下控制点直接影响结果判读，必须在原始记录中逐项填写：样品称量是否精确到 0.1 g；稀释液体积是否准确；均质时间与温度是否在范围内；每级稀释是否更换吸头；LST 管灭菌后小导管有无气泡；接种体积是否为 1 mL；培养温度与时间是否受控。记录表应能追溯到具体样品、具体操作人和具体时间，出现异常时便于复核。

完成接种后，将剩余匀液和稀释管按生物安全要求处理，不得随意丢弃。培养 24 h 后观察 LST 管是否产气，产气者继续做证实试验；未产气者再培养至 48 h 观察。只有把采样、制备、稀释、接种和记录串成完整链条，大肠菌群检测结果才具备可追溯性和判定价值。