4. 接种工具的准备与灭菌
接种工具是微生物从试管、菌种瓶转移到培养基上的“手”。在食用菌无菌操作中，工具本身若带菌，前面所有培养基灭菌、空间消毒的工作都会前功尽弃。本节围绕接种钩、接种铲、镊子、接种刀等常用工具，讲清材质怎么选、用前怎么洗、怎么包扎、高压蒸汽灭菌如何操作，以及灭菌后如何判断是否真正达到无菌状态。
一、材质选择：先看耐高温与导热性
食用菌接种工具的共同要求是：能承受121℃以上高压蒸汽反复灭菌、导热快、不易生锈、表面光滑不易藏污、有一定刚性又便于弯折成型。常用材质主要有三类。
- 不锈钢（304或316）：最常用。耐腐蚀、耐反复高压灭菌、表面光洁，适合制作接种钩、接种铲、镊子、接种刀。接种钩前端需弯成约90°的小钩，钩尖略钝，避免刺破菌丝或培养基表面。
- 镍铬合金/电热丝：多用于接种钩、接种环，导热快，适合酒精灯火焰灼烧灭菌，但刚性较弱，弯钩后易变形，适合小规模试管转接。
- 铝、镀锌铁：导热好、成本低，但耐腐蚀性差，反复高压灭菌易氧化发黑，不建议作为长期使用的接种工具，尤其不适合接触酸性培养基或长期潮湿环境。
镊子建议选不锈钢扁嘴或弯嘴镊，长度25～30 cm，便于在酒精灯火焰旁深入瓶口操作而不烫手。接种铲用于挖取菌种块，铲面要平整、边缘略钝，宽度约1～1.5 cm，与菌种瓶口匹配。工具手柄可缠绕耐高温硅胶或石棉绳，减少灼烧和高压灭菌后的烫手问题，但缠绕层必须能耐受反复灭菌、不脱落纤维。
二、清洗：去除有机物是灭菌成功的前提
高压蒸汽灭菌靠的是湿热穿透，工具表面若残留琼脂、菌丝、培养基干痂，蒸汽无法接触金属表面，灭菌就会失败。因此每次使用后应立即清洗，不能等干涸。
- 用清水冲去大块残留，再用软毛刷或百洁布蘸中性洗涤剂刷洗钩尖、铲面、镊子齿缝等死角。
- 用自来水冲洗至无泡沫，再用去离子水或蒸馏水淋洗一遍，减少水垢残留。
- 检查钩尖是否弯曲变形、镊子齿是否对齐、铲面是否有锈斑或划痕。变形工具应校正或更换，锈斑明显的工具不宜继续用于无菌操作。
- 晾干或用洁净纱布擦干。带水包扎会增加灭菌后包装内部冷凝水，影响无菌保持。
三、包扎：让蒸汽进得去、让杂菌进不来
包扎的目标有两个：一是灭菌时蒸汽能充分接触工具表面，二是灭菌后取出到使用前能阻挡环境杂菌。常用方式是牛皮纸包扎、铝箔包裹或装入耐高温灭菌袋。
- 牛皮纸包扎：将工具按使用顺序分组，钩尖朝同一方向，用牛皮纸卷包2～3层，外层用棉线扎紧，松紧适度。太紧蒸汽不易穿透，太松灭菌后易散开污染。
- 铝箔包裹：适合单件工具，包裹时留出开口方向，便于使用时从开口端抽出，避免手接触工具前端。
- 灭菌袋：选用耐高温自封灭菌袋，装入工具后排出多余空气，袋口留1/3空间，避免灭菌时袋内胀气破裂。
无论哪种方式，都应在包装外标注灭菌日期和批次。包扎好的工具不宜久放，建议在7天内使用；超过期限或包装受潮、破损，应重新灭菌。
四、高压蒸汽灭菌操作：排净冷空气是关键
接种工具通常采用121℃、0.1 MPa、维持20～30分钟的湿热灭菌条件。具体操作步骤如下，参数为教学示例，实际应以设备说明书和装载量调整。
1. 检查水位：加水至水位线，使用蒸馏水或软化水，避免水垢。
2. 装载：包扎好的工具竖放或斜放，不叠压，袋口朝上，留出蒸汽通道。
3. 密封：盖好锅盖，对角均匀拧紧螺栓，确认排气阀打开。
4. 加热排气：升温至排气阀连续排出白色蒸汽约3～5分钟，排净冷空气后关闭排气阀。
5. 升压灭菌：压力升至0.1 MPa（约121℃），开始计时，维持20～30分钟。
6. 降压：关闭热源，自然冷却至压力表归零，严禁带压开盖。
7. 取出：开盖后趁热取出，置于洁净台内冷却备用。装载量对灭菌效果影响很大。工具包之间应留2～3 cm间隙，总装载量不超过灭菌篮容积的70%～80%。若与培养基、器皿同锅灭菌，工具包应放在上层，避免被液体浸湿。灭菌结束后不要立即开盖，压力未归零时开盖会导致包装内蒸汽瞬间膨胀、冲破包装，造成二次污染。
五、灭菌效果检查：不能只看压力表
压力表到压、计时结束，只说明设备按设定运行，不等于工具真正达到无菌。实际生产中应从三个层面检查。
- 化学指示：在包装内放置压力蒸汽灭菌化学指示卡或指示胶带，灭菌后变色达到标准色块，说明该位置达到设定温度和时间。指示卡应放在工具包中心位置，而不是只贴在表面。
- 生物指示：定期用嗜热脂肪芽孢杆菌生物指示剂验证，灭菌后培养48小时观察是否变色。这是判断灭菌效果最可靠的方法，建议每月至少做一次，新设备或维修后必须做。
- 使用前目视检查：包装是否干燥、完整、无破损；指示胶带是否变色；工具表面是否洁净、无锈、无残留水珠。若包装内有冷凝水积聚，说明干燥不充分，应重新包扎灭菌。
六、使用环节的补充控制
灭菌合格的工具取出后，应在超净工作台或接种箱内冷却备用。接种过程中，每接完一管或一瓶，接种钩、接种铲应在酒精灯火焰上灼烧至红热，再冷却后使用；镊子可蘸取75%酒精后火焰灼烧。灼烧后的工具不要立即插入菌种，应等待2～3秒或触碰无菌培养基边缘冷却，避免高温烫伤菌丝。
工具使用完毕，应立即清洗、干燥、重新包扎灭菌，不要带着培养基残渣放置过夜。建立工具使用记录，写明灭菌日期、灭菌锅编号、指示卡结果和操作人，便于出现污染时追溯。对于反复灭菌后出现锈斑、钩尖变形、镊子齿闭合不严的工具，应及时淘汰，不能因为“还能用”而继续用于无菌接种。