第2章 实验设计三原则：对照、随机化、重复与区组设计
2.1 适用场景
本章内容适用于以下实验场景：
- 验证性实验——需要明确判断处理效应是否存在，排除非实验因素干扰的场景，如新药疗效、工艺改进效果验证。
- 比较性实验——多个处理组之间或处理组与对照组之间进行定量比较的场景，如不同施肥方案对产量的影响。
- 优化性实验——在已知变异源基础上寻找最优处理条件的场景，如反应温度、压力、催化剂用量的组合优化。
- 可重复性要求高的实验——实验结论需要经受第三方复现检验的场景，如法规注册申报、学术论文核心结论验证。
- 多因素交互作用研究——需要同时考察多个因素及其交互效应的实验场景，如药物-剂量-给药方式的联合效果分析。
适用判断提示： 如果实验结论将被用于决策（如上市审批、工艺放行、资源分配），则必须完整应用本章四项原则。仅用于内部探索性筛选时，可酌情简化重复数和区组结构，但对照和随机化不可省略。
2.2 前置条件
在应用实验设计三原则之前，必须完成以下准备工作：
| 序号 | 前置条件 | 具体要求 |
|---|---|---|
| 1 | 明确的研究问题 | 以可检验假设形式（H₀ / H₁）清晰表述，如“新配方使收率提高至少5%” |
| 2 | 实验单元定义 | 确定独立实验单元（如小鼠个体、反应釜批次、田块）及其同质性范围 |
| 3 | 处理因素与水平 | 列出所有待考察因素（自变量）及其水平，区分处理因素与区组因素 |
| 4 | 观测指标与测量方法 | 确定主要响应变量（因变量），确保测量精度和重复性符合要求 |
| 5 | 已知变异源清单 | 识别可能影响响应的非处理因素（如操作人员、设备差异、时间批次） |
| 6 | 统计参数预设 | 预设显著性水平α、检验功效1-β、可检测的最小效应量δ |
常见前置缺失： 未识别已知变异源就直接设计实验，导致区组划分失效；或未预设效应量就估算样本量，造成重复数不足或浪费。上述两种情形在SOP审核中属于“前置条件不满足”，应退回补充。
2.3 操作步骤
按照以下六步流程在实验设计中落实四项原则：
- 步骤一：设置对照（对照原则）
确定至少一个对照组（阴性对照/阳性对照/空白对照），对照组除缺失处理因素外，其他条件与处理组完全一致。对照类型选择标准见下表。 - 步骤二：随机化分组（随机化原则）
使用随机数生成器（如R软件sample()、Pythonrandom.shuffle、随机数表）将实验单元分配至各处理组，确保每个单元有均等概率进入任意组。严禁按“方便”或“主观判断”分组。 - 步骤三：确定重复次数（重复原则）
基于预设的α、1-β、δ以及变异估计值，使用功效分析软件（如G*Power、PASS、Rpwr包）计算所需重复数（样本量）。重复指独立实验单元的重现，而非同一单元的重复测量。 - 步骤四：划分区组（区组设计）
将已知变异源（如批次、动物窝别、操作人员）作为区组因素，将同质单元组成区组，在区组内实施随机化处理分配。区组大小应等于处理组数或处理组数的整数倍。 - 步骤五：编制实验方案文档
将以上四项原则的具体实施方案撰写为实验方案，包含分组方案、随机化序列、区组结构、样本量计算过程。 - 步骤六：方案预演与审核
由独立审核人（非设计者）检查对照设置是否完整、随机化是否可追溯、重复数是否充足、区组划分是否合理。通过预演发现潜在执行问题。
| 对照类型 | 适用场景 | 示例 |
|---|---|---|
| 阴性对照 | 排除安慰剂效应或自然变化 | 空白培养基、生理盐水注射 |
| 阳性对照 | 确认实验系统灵敏度 | 已知有效药物、标准工艺条件 |
| 空白对照 | 测量基线水平 | 未处理样本、零时刻测量 |
| 自身对照 | 同一单元处理前后比较 | 用药前后血压变化（需注意时间效应） |
步骤关键检查点： 在步骤二完成后，使用统计检验（如卡方检验）确认各组在已知协变量上是否均衡。若发现不均衡，应重新随机化或采用分层随机化（属于区组设计的变体）。
2.4 输入输出物
| 类别 | 输入物 | 输出物 |
|---|---|---|
| 文档类 | 研究假设书、文献综述、变异来源分析表 | 实验设计方案（含四项原则应用说明） |
| 数据类 | 历史变异数据、预实验数据、参考标准值 | 样本量计算报告、随机化分配表、区组划分记录 |
| 工具类 | 随机数生成器、功效分析软件、区组分配模板 | 随机化种子号记录、区组-处理对照矩阵 |
| 审批类 | 方案审核清单、合规性检查表 | 已签署的实验方案审批页、伦理批准文件（如需） |
2.5 责任边界
| 角色 | 职责范围 | 责任边界说明 |
|---|---|---|
| 实验设计者 | 方案设计、原则应用、样本量计算、方案撰写 | 对四项原则的完整性和正确性负责，需在方案中逐条说明原则应用依据 |
| 实验执行者 | 按随机化序列操作、区组管理、数据记录 | 对违反随机化或区组方案的操作负责，任何偏离需记录偏差报告 |
| 数据分析者 | 验证随机化完整性、确认区组结构、选择分析模型 | 对因违反原则导致的统计方法误用负责，有权退回不符合原则的数据集 |
| 质量审核者 | 方案合规性审核、异常处理裁决 | 对原则应用的合规性进行独立审核，对异常处理方案拥有否决权 |
2.6 记录材料
在应用实验设计四项原则的过程中，必须形成并保存以下记录：
| 记录编号 | 记录名称 | 主要内容 | 保存形式 |
|---|---|---|---|
| REC-2-01 | 对照设置声明 | 对照类型、数量、设置依据、对照条件与控制措施 | 纸质/电子签名文档 |
| REC-2-02 | 随机化分配记录 | 随机化方法（软件/表）、种子号、分配序列、分组结果表 | 电子原始文件（可审计追踪） |
| REC-2-03 | 样本量计算报告 | α、1-β、δ、变异估计值、计算公式、计算结果、参考文献 | PDF或计算软件源文件 |
| REC-2-04 | 区组划分记录 | 区组因素、区组大小、区组内单元清单、区组-处理分配表 | 结构化表格（CSV/Excel） |
| REC-2-05 | 方案偏离记录 | 偏离环节、原因、影响评估、纠正措施、审批人 | 偏差报告（电子签批） |
记录保存建议： 随机化种子号和分配序列应在分组完成前密封保存，避免提前泄露导致选择偏倚。区组划分记录应与随机化分配记录分开存储，由不同人员保管。
2.7 异常处理
| 异常情形 | 可能原因 | 处理措施 | 责任角色 |
|---|---|---|---|
| 随机化后组间协变量不均衡 | 样本量过小、随机化种子选择不当 | ① 检查随机化过程是否有误；② 若过程正确，采用分层随机化或协变量调整分析；③ 记录为方案偏离 | 设计者 + 审核者 |
| 实验单元在过程中死亡/脱落 | 意外事件、毒性超预期、管理失误 | ① 记录脱落单元所属组别和区组；② 评估是否影响统计功效；③ 按预设规则决定是否补充单元 | 执行者 + 数据分析者 |
| 区组划分后发现组内异质性仍过大 | 区组因素选择不当、遗漏重要变异源 | ① 重新评估变异源清单；② 若在实验启动前，调整区组结构；③ 若已启动，按原区组分析并在结论中说明局限性 | 设计者 + 审核者 |
| 对照条件被污染或失效 | 操作失误、设备交叉污染、环境变化 | ① 立即停止该单元数据使用；② 评估是否影响其他单元；③ 补充独立对照单元并记录 | 执行者 + 质量审核者 |
| 重复数不足（功效低于预设） | 变异估计偏低、效应量高估 | ① 基于实际变异重新计算功效；② 若无法增加样本量，在报告中明确功效限制；③ 避免对阴性结论做绝对化解释 | 数据分析者 + 设计者 |
异常处理红线： 任何情况下不得在已知分组信息后调整随机化序列或重新分组。若发现随机化被破坏，该批次数据应标记为“非随机化”数据，仅可用于探索性分析，不可用于验证性假设检验。
2.8 验收标准
实验设计方案在进入执行阶段前，必须通过以下验收检查：
| 检查项 | 验收标准 | 检查方法 |
|---|---|---|
| 对照原则 | 至少设置1个有效对照组，对照条件与处理组除处理因素外完全一致 | 查阅对照设置声明，逐条比对处理组与控制条件 |
| 随机化原则 | 随机化方法可追溯、种子号可复现、分配结果无主观干预证据 | 审查随机化记录，使用相同种子号复现序列，确认与实际分组一致 |
| 重复原则 | 每组独立重复数 ≥ 功效分析计算值，且不低于领域最低标准（如临床前实验每组≥6） | 查看样本量计算报告，核对重复数是否满足预设功效（≥0.8） |
| 区组设计 | 区组因素明确、区组划分逻辑合理、区组内单元同质、区组大小与处理组数匹配 | 审查区组划分记录，计算区组内变异与区组间变异比值（F检验） |
| 文档完整性 | REC-2-01 至 REC-2-05 五项记录齐全，均有责任人签名和日期 | 逐项核对记录清单，检查签名和日期完整性 |
| 合规性 | 方案通过独立审核人审签，无未关闭的偏差项 | 查看方案审批页和偏差跟踪表 |
验收结论判定： 以上六项检查项全部“通过”时，方案可进入执行阶段。任意一项“不通过”时，由设计者根据审核意见修改方案，重新提交验收。连续两次验收不通过需升级至质量负责人裁决。
图2-1 实验设计四项核心原则及其协同关系结构图